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Tanino no Grão de Sorgo – Bases Fisiológicas e Métodos de Determinação

Introdução

O sorgo é uma planta que pertence à família Graminea/Poaceae e o seu nome científico é Sorghum bicolor L. Moench. Atualmente, ocupa, entre os cereais, o quinto lugar em área plantada no mundo, atrás do trigo, arroz, milho e cevada. A produção de sorgo na América do Norte, América do Sul, Europa e Austrália se destina principalmente à alimentação animal, ao passo que na Ásia, África, Rússia, China e América Central, o grão é importante como alimento humano básico.

Devido ao fato de não apresentar uma proteção para as sementes, como, por exemplo, a palha do milho ou glumas do trigo e da cevada, a planta de sorgo produz vários compostos fenólicos, os quais servem como uma defesa química contra os pássaros, patógenos e outros competidores.

Toda planta de sorgo possui aproximadamente os mesmos níveis de proteína, amido, lipídio etc., porém vários compostos fenólicos podem ocorrer ou não; entre esses compostos, destaca-se o tanino condensado, que tem ação antinutricional, principalmente para os animais monogástricos. Como esses polifenóis são metabólicos secundários, ou seja, não participam de vias metabólicas responsáveis por crescimento e reprodução, a presença e a natureza deles variam enormemente.

A presença do tanino no grão de sorgo depende da constituição genética do material. Os genótipos que possuem os genes dominantes B1 e B2 são considerados sorgo com presença de tanino. No passado, era comum encontrar a classificação de sorgo nos grupos I, II e III, representando, respectivamente, teores baixos, médios e altos de tanino. Hoje, sabe-se que o tanino está presente ou ausente no grão. A pesquisa tem mostrado que percentuais abaixo de 0,70% no grão, verificados em algumas análises  laboratoriais, são devido a outros fenóis e não ao tanino condensado e, portanto, não são prejudiciais à dieta alimentar dos animais.

O tanino no sorgo tem causado bastante controvérsia, uma vez que, apesar de algumas vantagens agronômicas, como a resistência a pássaros e doenças do grão, ele causa problemas na digestão dos animais pelo fato de formarem complexos com proteínas e, assim, diminuírem a sua palatabilidade e digestibilidade.

A determinação da presença dos taninos no grão de sorgo apresenta vários problemas, uma vez que os métodos colorimétricos geralmente não diferenciam taninos de outros compostos fenólicos. Outra dificuldade é a obtenção de substâncias adequadas para serem utilizadas como padrão para esses métodos.

Tipos de Compostos Fenólicos Presentes no Grão

Os vários compostos fenólicos presentes no grão de sorgo podem afetar a cor, a aparência e a qualidade nutricional. Esses compostos podem ser classificados em três grupos básicos: ácido fenólicos, flavonóides e taninos. Os ácidos fenólicos são encontrados em todo o tipo de sorgo, porém os flavonóides não são detectados em todos eles. O fenol conhecido como tanino encontra-se concentrado na testa da semente. A testa é um tecido altamente pigmentado, localizado logo abaixo do pericarpo, e sua existência é fator determinante da presença de tanino em sorgo. Existem duas classes de taninos: hidrolizáveis e condensados. Não há evidências da presença de grandes quantidades de tanino hidrolizável no sorgo. Já o tanino condensado é aquele encontrado em sorgo resistente a pássaros.

Os ácidos fenólicos não têm efeito adverso na qualidade nutricional, porém podem causar cor indesejável aos alimentos, quando processados sob condições alcalinas. Os flavonóides, a exemplo dos ácidos fenólicos, também não causam problemas na digestibilidade e palatibilidade do sorgo. Constituem um amplo grupo de compostos fenólicos encontrados nas plantas, sendo que alguns deles estão entre os principais pigmentos presentes em vegetais.

Formação do Complexo Tanino – Proteína

O principal problema que o tanino causa, quando presente no sorgo, é a complexação com proteínas, o que vai afetar a digestibilidade e modificar a palatabilidade (sabor adstringente).

Com base em muitos estudos, acredita-se que a associação do tanino com a proteína e a estabilidade desse complexo se deve sobretudo à formação de pontes de hidrogênio e interação hidrofóbica entre essas moléculas. As proteínas diferem enormemente quanto à sua afinidade pelos taninos. As principais características das proteínas que influenciam positivamente nessa associação são: alto peso molecular, estrutura mais aberta e flexível, ponto isoelétrico e conteúdo de prolina. Essa última característica é provavelmente o mais importante fator que interfere na associação entre taninos e proteínas do sorgo, uma vez que a prolina possui característica hidrofóbica e contribui para a conformação mais aberta da molécula de proteína. Com relação à estrutura e propriedade dos polifenóis importantes na formação mais aberta da molécula de proteína. Com relação à estrutura e propriedade dos polifenóis importantes na formação do complexo tanino-proteína, destacam-se três características: maior tamanho do polifenol, conformação flexível, cuja retração facilita a ligação polifenol/proteína e a baixa solubilidade do polifenol.

Vantagens da Presença do Tanino

Sob o ponto de vista agronômico, as principais vantagens do tanino são: resistência a pássaros, resistência aos fungos causadores da podridão no grão antes da colheita, redução na germinação de grãos na panícula e resistência a insetos.

Entre as vantagens do tanino, a resistência a pássaros é talvez a mais importante, pois, em algumas regiões produtoras de sorgo, o dano causado por pássaros é tão severo que a perda da cultura pode ser total. A maior incidência do ataque de pássaros se verifica no estádio de grão leitoso a pastoso. A resistência verifica nessa fase se deve à adstringência causada pelo tanino ao formarem complexos e precipitarem as proteínas. Ressalta-se, no entanto, que, dependendo da densidade populacional dos pássaros e da não disponibilidade de outros alimentos mais palatáveis na área, eles podem até consumir sorgo com tanino.

A resistência verificada aos fungos causadores de podridão no grão antes da colheita é outra significativa vantagem do tanino, uma vez que esses fungos podem comprometer a produção e a qualidade de grãos e sementes, possivelmente reduzindo também a concentração de aflotoxina na massa de grãos. As condições ideais para o desenvolvimento dos fungos são a ocorrência de temperaturas elevadas e altas umidades por ocasião da maturação do sorgo.

O tanino reduz também a germinação na panícula, que comumente ocorre durante períodos prolongados de chuva, após a maturação fisiológica, quando as altas temperaturas e umidade favorecem a germinação. O provável modo de ação do tanino nesse caso está relacionado com o mecanismo de dormência da semente, uma vez que, encontrando-se na testa da semente, o tanino pode retardar a absorção água, atrasando, conseqüentemente, a germinação. Além disso, o tanino pode formar complexos e inativar enzimas envolvidas no processo de germinação.

A resistência a insetos está relacionada principalmente com os afídeos, no período inicial de crescimento do sorgo. Os compostos fenólicos não controlam, no entanto, insetos de grãos armazenados.

 
Desvantagens do Tanino no Grão

A principal desvantagem do tanino nos grãos de sorgo é o seu efeito antinutricional, causado pelo complexo tanino-proteína, o qual provoca uma diminuição da digestibilidade, limitando, assim, o uso do sorgo na dieta animal, principalmente dos monogástricos. O efeito do tanino na digestibilidade "in vitro" da matéria seca tem sido provado em vários estudos, nos quais foi detectada correlação negativa entre a presença de tanino no grão e a digestibilidade.

O efeito antinutricional do tanino pode ser melhor avaliado quando se compara o desempenho de aves alimentadas com ração de sorgo com e sem esse composto fenólico. A resposta dos animais à dieta com tanino é verificada pela hipertrofia da glândula parótida, com produção de proteínas ricas em prolina. O tanino, além de conferir cor indesejável à ração, diminui a palatabilidade e reduz o ganho de peso dos animais monogástricos.

Remoção do Tanino nos Grãos Através de Métodos de Desintoxicação

O tanino, quando desejável, pode ser removido do grão para superar a sua principal desvantagem, que é a características antinutricional. Essa remoção pode ser tanto química quanto física. Dentre os métodos químicos de remoção, destacam-se o uso de água, HCl, de hidróxico de amônio, de hidróxico de potássio e de hidróxico de sódio. Todos esse reagentes removem com sucesso o tanino. Já a remoção mecânica envolve processos abrasivos, que podem, muitas vezes, reduzir o conteúdo de proteína. Há, inclusive, uma redução progressiva dos aminoácidos lisina, histidina e arginina.

Métodos para Quantificar o Tanino

Os métodos colorimétricos são os protocolos mais comuns, sensíveis e baratos utilizados para se determinar a presença de tanino em sorgo. Todo método tem a sua limitação e a escolha específica de uma metodologia muitas vezes é baseada nas facilidades estruturais disponíveis e no número de amostras a serem avaliadas. A intenção aqui é descrever resumidamente o princípio de cada método, apontar as vantagens e desvantagens de cada um, assim como os resultados mais recentes obtidos em pesquisa conduzida para correlacionar o desempenho de aves, com diferentes metodologias de detecção de tanino.

Os métodos colorimétricos podem ser divididos em dois grupos básicos: aqueles em que a reação ocorrem com grupos fenólicos gerais, envolvendo as reações de oxi-redução ou formação de complexos com íons metálicos, (ex: Folin Denis e Azul da Prússia) e aqueles em que as reações ocorrem com um grupo funcional específico, devido a uma estrutura em particular dos taninos (ex: Butanol-HCl e Vanilina-HCl). Na interpretação dos resultados, é aconselhável que se tenha um conhecimento básico da especificidade de cada método.

Os métodos Folin-Ciocalteu, Folin-Denis e Azul da Prússia quantificam fenóis totais e se baseiam nas reações de oxi-redução entre os compostos fenólicos e íons metálicos. Esses Protocolos não discriminam tanino e outros compostos fenólicos. Ressalta-se, no entanto, que o sorgo não tem mostrado, na sua constituição química, grandes quantidades de outros campos fenólicos além do tanino.

O método Folin-Ciocalteu é bastante antigo e está fora de uso. Foi substituído pelo Folin-Denis, que se baseia na redução em meio alcalino dos fosfomolibdato-fosfotungstato pelos fenóis, a molibdênio de coloração azul. O padrão utilizado pelo método Folin-Denis é o ácido tânico, fonte comercial de um tanino hidrolizável. Esse foi um protocolo bastante utilizado no ano passado, porém hoje já é considerado superado e laborioso, além de superestimar a porcentagem de tanino.

O método Azul da Prússia é recomendado para análise geral de fenóis, porque é menos susceptível à interferência de proteína que o método Folin-Denis. A base química dessa metodologia é a redução pelos grupos hidroxi-fenólicos de íons Fe+3 a Fe+2, os quais são complexos com ferrocianeto, para produzir pigmentos de coloração azul. Os métodos em que ocorre a formação de complexos entre íons metálicos e grupos fenólicos (Azul da Prússia) são mais específicos que os métodos de oxi-redução (Folin-Denis).

O padrão utilizado para Azul da Prússia é o ácido tânico. Essa metodologia é a comumente utilizada no Laboratório de Fisiologia Vegetal da Embrapa Milho e Sorgo. Apresenta uma série de vantagens em relação aos demais métodos, como, por exemplo: rapidez, simplicidade, sensibilidade e preço baixo. Além disso, apresenta uma vantagem ainda mais expressiva, que é a sua correlação com o desempenho de aves. A desvantagem desse protocolo é que ele detecta fenóis totais; contudo, esse fato tornou-se irrelevante após alguns trabalhos de pesquisa, comparando métodos para quantificar taninos em sorgo, demonstraram maior correlação dos fenóis totais determinados por essa metodologia com o ganho de peso das aves e a digestibilidade "in vitro" da matéria seca.

Os métodos Butanol-HCl e Vanilina-HCl detectam funcionais específicos de taninos, os quais exploram as diferenças estruturais que ocorrem na molécula dos taninos. O Butanol-HCl é específico para proantocianidina (tanino condensado). Esse método é considerado o melhor para determinação do tanino  condensado. Através de metodologia, sub unidades do polímero tanino condensado são oxidadas para produzir antocianidina. Essa reação não envolve hidrólise.

Utiliza-se como padrão o tanino purificado que pode ser obtido da planta "quebracho", originária da América Central, ou também do "barbatimão". A principal vantagem dessa metodologia é que ela determina os teores de tanino condensado, enquanto que as desvantagens são: métodos laboriosos, custo e a dificuldade em se obter o padrão, uma vez que o tanino purificado não é comercializável, ou seja, o laboratório terá que purificar seu próprio tanino para utilizá-lo como padrão. Convém salientar que a purificação do tanino é um processo muito difícil, uma vez que os extratos, além de conterem tanino, possuem proteínas complexas com tanino e compostos fenólicos que não são tanino.

O método Vanilina-HCl fundamenta-se na reação da leucoantocianidina (catequina) e proantocianidina (tanino) com vanilina, em presença de HCl, para formar um composto de cor vermelho – brilhante. É um método específico para tanino condensado e alguns flavonóides. Utiliza-se, para esse método, a catequina como padrão. Dentre as vantagens dessa metodologia, está a detecção de tanino condensado. As desvantagens são: superestima o conteúdo de tanino, é laborioso e possui custo alto.

Uma das limitações dos métodos colorimétricos é a obtenção de substâncias adequadas para serem utilizadas como padrão. Os padrões normalmente utilizados não fornecem o mesmo espectro de absorção do tanino purificado.

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